内毒素与脂肪性肝病

1 内毒素与酒精性肝病

　　最初，人们认为酒精性肝病是由于长期摄入酒精继发营养不良所致。20世纪80年代后的研究证实，乙醇对肝细胞有直接毒性作用。近年来的研究又显示乙醇不仅对肝细胞有直接毒性作用，还对肝脏间质细胞，尤其是Kupffer细胞有激活作用。目前，许多学者认为肠源性内毒素血症及其对Kupffer细胞的激活是乙醇一系列肝毒性作用的起始事件。

1.1　酒精性肝病存在内毒素血症

　　无论是急性酗酒抑或慢性嗜酒者，内毒素血症的发生率均明显增高。Bode等报道24例急性酗酒者，45.7%发生内毒素血症，而88例酒精性肝硬化患者，内毒素血症的发生率为67.3%，较非酒精性肝硬化45.5%的发生率显著增高。Fukui等报道85例酒精性肝病患者，其中酒精性肝硬化64例，酒精性肝炎11例，酒精性脂肪肝10例，其血清内毒素浓度均明显增高，在各种酒精性肝病中均常见高浓度的内毒素血症，与非酒精性肝硬化组相比均有显著差异，从而提示内毒素血症的发生与滥用酒精有关。

　　在Tsukamoto-French酒精性肝病大鼠模型中，连续饲予酒精2周，血清内毒素浓度较正常大鼠升高近5倍，且血清内毒素水平与肝脏病理学积分呈正相关。而在给上述动物模型服用乳酸杆菌抑制肠道革兰阴性杆菌生长或服用多粘菌素B、新霉素等抗生素净化肠道后，外周血内毒素水平降至正常，肝脏病理变化也有明显好转，从而证实酒精性肝病时，血中增高的内毒素主要来自肠道。

　　酒精饲养大鼠肠道负荷内毒素后，血清ALT水平较对照组和单用酒精组均显著增高，肝组织则严重损害，证实内毒素可以加重酒精性肝损害。

1.2 发生机制

1.2.1 酒精引起肠道菌群紊乱

　　正常人十二指肠、空肠及近端回肠仅存在少量细菌，且主要为需氧的革兰阳性球菌。如果上段小肠需氧细菌数目超过105/ml，称为细菌过度繁殖。20世纪80年代中期，Bode等报道慢性嗜酒者的空肠存在革兰阴性杆菌过度生长现象。服用乳酸杆菌或抗生素可使酒精诱导的内毒素血症消失，同样也说明肠道菌群紊乱的存在。嗜酒者胃酸减少，胃液pH增高，杀菌作用减弱，使细菌进入小肠过多，是引起肠道细菌过度生长及菌群紊乱的原因之一。还有学者认为饮食中脂肪的种类可以影响酒精对肠道菌群的改变，即富含不饱和脂肪酸的饮食可促进酒精性肝损害，而同时摄入富含饱和脂肪酸的牛油，肠道菌群数量及组成仍正常，酒精性肝损害也随之减轻。

1.2.2 .肠粘膜通透性增高

　　正常哺乳动物肠粘膜屏障就不很完整，可允许少数大分子物质通过，如一些抗原等。在急性或慢性摄入酒精时，肠粘膜屏障受损，肠粘膜对血红蛋白、辣根过氧化物酶、聚乙烯吡咯烷酮等大分子物质通透性增高。在嗜酒者，肠粘膜对标记的EDTA通透性是正常人的2倍，且通透性改变的部位发生在小肠。近来又有实验表明嗜酒者肠粘膜对分子量在1500-10000的大分子物质通透性也明显增高，对分子量400的小分子物质的通透性则无变化。另一项研究表明30例酒精性肝病及非酒精性肝病患者粪便中内毒素最小分子量为3800，提示嗜酒者肠粘膜对内毒素的通透性也会增加。体外实验已证实，分离的小肠对标记的内毒素通透性的增高与接触的酒精呈量效关系。Mathurin等则证明喂食酒精鼠的肠道对内毒素的通透性增加，肠道负荷内毒素后，门静脉内毒素水平增加。

　　Keshavarzian等则进一步证实了胃肠通透性增加与人类酒精性肝病有关。蔗糖吸收试验可评价胃-十二指肠粘膜渗透性，而甘露醇、乳果糖吸收试验以及尿乳果糖/甘露醇之比（L/M）则被用来评价远端肠道的渗透性。研究者用上述吸收试验将10例酒精性肝病患者的胃-十二指肠和较远端肠道粘膜渗透性分别与对照组、不伴肝病的嗜酒者以及无嗜酒史的肝病患者相比较。结果对照组的平均蔗糖分泌是8mg/5h，无嗜酒史的肝病患者蔗糖分泌与对照组相似，不伴肝病的嗜酒者的蔗糖分泌比对照组高6倍，而10例酒精性肝病的蔗糖分泌比对照组显著增高达38倍，也是不伴肝病嗜酒者的6倍。酒精性肝病患者无论乳果糖吸收以及尿乳果糖/甘露醇之比均较对照组显著升高，而不伴肝病的嗜酒者以及无嗜酒史的肝病患者乳果糖吸收以及尿乳果糖/甘露醇之比均在正常范围。由于仅有酒精性肝病患者肠道通透性显著增加，所以研究者认为有渗漏的肠道是嗜酒者发生慢性肝病所必需的协同因素。

　　应用电子旋转共振技术进行物理化学研究表明，酒精可改变细胞膜脂质与脂蛋白比例，从而增加细胞膜的流动性，而细胞膜流动性的增加，则导致细胞对大分子物质转运与吸收的增加。肠粘膜细胞间连接消失也可能是肠粘膜通透性增高的原因之一。一项酒精性肝病大鼠模型研究发现，电镜下可见大鼠十二指肠粘膜细胞间连接部分消失，并见到辣根过氧化物酶从肠粘膜细胞间穿入。已知胃肠粘膜的紧密连接是肠粘膜屏障的主要成分。通过紧密连接的细胞旁路径被动转运调节着肠腔内许多物质的吸收。

1.2.3 酒精对Kupffer细胞的影响

　　生理状态下，即使门静脉内存在内毒素血症，由于肝脏单核巨噬细胞系统，主要是Kupffer细胞对内毒素有强大的清除能力，一般不至于造成体循环内毒素血症。酒精可以影响Kupffer细胞的吞噬、杀菌、生成细胞因子等功能。事实上，酒精既可引起Kupffer细胞对内毒素的耐受，也可引起其对内毒素的敏感，这取决于酒精作用时间的长短。给予酒精后2小时分离出的大鼠Kupffer细胞，无论受低浓度或高浓度的内毒素刺激，所产生的TNF-α量均较正常Kupffer细胞减少，内毒素受体CD14的表达不变。而给予酒精后24小时分离出的大鼠Kupffer细胞，所产生的TNF-α量较正常Kupffer细胞明显增高，CD14的表达上调。同时，前者细胞内Ca2+浓度上升幅度较正常Kupffer细胞小，而后者细胞内Ca2+浓度上升幅度较正常Kupffer细胞大。由于Ca2+通道阻滞剂尼莫地平可以减轻酒精性肝损害，故Ca2+通道被认为在Kupffer细胞激活中起重要作用。同时给予抗生素的大鼠，其Kupffer细胞无论是在2小时或24小时都无以上变化。从以上的实验可以看出，酒精作用后的短时间内，Kupffer细胞处在抑制状态，长时间后则处在激活状态，从而产生更多的包括细胞因子在内的炎症介质，对肝脏产生损害。

　　酒精诱导的肠源性内毒素血症在Kupffer细胞功能变化中起着调节作用,但在没有内毒素存在的情况下，酒精本身也可影响Kupffer细胞，使其处在激活状态。如前文所述，酒精可增加各种细胞的胞膜流动性，对Kupffer细胞的胞膜也有同样作用，使其Ca2+内流增加，膜磷脂酰肌醇的转移和花生四烯酸的代谢发生变化，从而导致第二信使的释放，刺激蛋白激酶C活化，并转移至细胞膜。蛋白激酶C活化后，又可诱导NADPH氧化酶系统移位至胞膜，导致氧自由基的形成。反应性氧，尤其是H2O2，可作为第二信使，激活并使核转录因子移位，从而增加一些化学因子和细胞因子的基因表达。因此，在没有内毒素存在的情况下，酒精也可直接促进体外培养的Kupffer细胞合成和分泌化学因子RANTES，即正常T细胞表达和分泌的、活化时减少因子(RANTES)。

1.2.4 外周血内毒素灭活能力下降

　　有研究表明，酒精性肝硬化患者血浆内毒素浓度高于非酒精性肝硬化患者，且与高密度脂蛋白-胆固醇浓度呈负相关。将酒精性肝病患者的全血与内毒素共同孵育，则轻、中、重度酒精性肝病全血内毒素结合力分别是正常的85.8%、25.4%、43.6%，提示酒精性肝病患者外周血液灭活内毒素的能力下降，从而更易于形成内毒素血症。

1.3 Kupffer细胞激活

　　肝细胞膜上有内毒素及脂多糖(LPS)类脂A的受体，所以内毒素可以直接作用于肝细胞引起肝脏损害。但酒精性肝病时，内毒素对肝脏的损害主要是通过激活Kupffer细胞，释放一系列生物活性物质引起的。酒精喂养的大鼠，用氯化钆抑制其Kupffer细胞活性后，造模大鼠血清酶学水平、肝脏脂肪变、炎症及坏死程度均明显改善。另外，无论是酒精性肝病患者或酒精性肝病动物模型，血清和肝脏的TNF-α水平均明显增高，用抗TNF-α抗体阻断TNF-α活性也可预防或减轻酒精对肝脏的毒性损伤。已知，只有单核-巨噬细胞系统才能产生TNF-α，而Kupffer细胞是体内单核-巨噬细胞系统的主要成分。

　　长期接触酒精后，酒精及其代谢产物以及内毒素均可激活Kupffer细胞，其中内毒素的作用最为重要。内毒素与血清脂多糖结合蛋白（LBP）结合后，再与Kupffer细胞膜上的CD14受体和TLR4受体相互作用，通过激活核转录因子kappa B（NF-κB）或其它转录因子，促进各种细胞因子（TNF-α、IL-1等）和化学因子的基因转录。在缺乏CD14的情况下，内毒素也可激活Kupffer细胞，这时可能由粘附分子CD11c/CD18作为跨膜信号传导受体。目前研究表明，肠源性内毒素诱导Kupffer细胞激湿酒精性肝病发生的早期关键步骤，其机制涉及细胞因子和化学因子的作用、脂类炎症介质的作用、高代谢状态和缺氧状态的形成以及氧应激和自由基产生增多等多方面。

２　内毒素与非酒精性脂肪性肝病

　　NAFLD在肝脏组织学上包括单纯性脂肪肝、NASH、脂肪性肝纤维化至脂肪性肝硬化一系列改变。NAFLD一般与肥胖、高脂血症、2型糖尿病等代谢综合症疾病相关。对于NFALD肠源性内毒素血症的研究开展得较晚，深入的研究相对较少。

　　早期少量研究有一些支持证据。如Barber等报道缺乏谷氨酰胺和纤维素的饲料可以导致大鼠出现肠道细菌过度生长、肝脏脂肪浸润以及对内毒素的易感性增高，而已知饮食缺乏谷氨酰胺和纤维素均可导致肠道环境异常。临床研究中最有说服力的是Goto等曾报导337名72岁老人，其中21.5%存在内毒素血症，且血清内毒素水平与血甘油三酯水平及体重指数（kg/m2）呈正相关。

　　Wigg等研究了22例NASH患者以及23例对照者，14C-D-木糖和乳果糖呼气试验显示50％的NASH患者存在小肠细菌过度生长，而对照组只有22％有此现象，并且NASH患者血清TNF-α水平增高。此后又有数项报道支持这一发现。但是这些研究均未发现NASH患者存在外周血内毒素血症和肠粘膜渗透性增加。

　　国外研究NAFLD的实验动物多采用ob/ob小鼠和fa/fa大鼠。前者由于瘦素基因突变不能合成瘦素，后者由于瘦素受体基因突变，瘦素启动的信号传导被抑制。两者都有自发性脂肪肝，同时还表现出胰岛素抵抗、肥胖、脂质代谢紊乱等与人类NASH密切相关的病变。fa/fa大鼠和ob/ob小鼠的肝脏和腹膜巨噬细胞的一些基础状态的表现类似与正常动物的巨噬细胞受内毒素刺激后的表现，比如巨噬细胞吞噬功能下降，Kupffer细胞特异受体表达下调，细胞因子和前列腺素类物质生成异常，提示内源性接触内毒素可能是此类动物巨噬细胞表型变化的原因之一。虽然目前没有ob/ob小鼠体循环或门静脉存在内毒素血症的证据，但有研究表明衰老的ob/ob小鼠存在肠道淤滞和细菌过度生长，肠道细菌产生的乙醇和其它产物增多，口服益生菌VSL#3的确可使ob/ob小鼠脂肪性肝炎得到明显改善。

　　范建高等通过给予SD大鼠持续24周的高脂饮食，建立了大鼠单纯性脂肪肝（4周～8周）→脂肪性肝炎（12周~16周）→肝纤维化（24周）模型，动态观察了大鼠外周血和门静脉血内毒素水平的变化。高脂饮食模型大鼠腹主动脉血内毒素水平在4周-16周未见异常，24周则明显升高。该结果表明在单纯性脂肪肝和NASH早期，模型大鼠并不存在一般意义上的“内毒素血症”，但是与益生菌VSL#3效果相似，高脂饮食8周起给予乳果糖口服能明显改善高脂饮食大鼠血清转氨酶和肝组织炎症。已知乳果糖有调节肠道菌群、减少肠源性内毒素血症发生等作用。

　　韩德五等研究则有不同的发现。88%普通饲料+10%猪油+2%胆固醇喂养12周，大鼠出现脂肪性肝炎和内毒素血症，而20%玉米油饮食5周起，大鼠内毒素水平持续增高，11周-14周达高峰，肝组织学在6周-7周表现为单纯性脂肪肝，9周-11周出现脂肪性肝炎。研究者认为，内毒素血症伴随NAFLD 发生发展的整个过程。

　　虽然关于肠道菌群紊乱、肠粘膜通透性改变以及肠源性内毒素血症究竟在NAFLD的发病中起了什么作用目前还没定论，但有一点是肯定的，即NAFLD动物对内毒素的敏感性增高，小剂量内毒素就可引起明显的肝脏损伤，甚至急性肝功能衰竭。国外对ob/ob小鼠的研究以及国内徐正婕等对高脂饮食NAFLD大鼠的研究都显示了这一现象。

　　NAFLD对内毒素敏感性增高的机制尚不明确，一些研究报道可能与肝脏Kupffer细胞功能异常、肝脏促炎转录因子NFκB /抗炎转录因子过氧化物酶体增殖物活化受体（PPAR）失衡、内毒素受体表达上调等相关。Masaki近来报道脂联素（APN）对内毒素联合半乳糖胺诱导的KK－Ay肥胖小鼠急性肝损伤有保护作用。已知APN是一种脂肪细胞源性的细胞因子，包括肝脏在内的许多组织则富含APN受体。血清APN浓度与肥胖程度呈负相关，低APN血症参与了2型糖尿病、高血压、冠心病等的发生和发展。APN是肥胖相关疾病的一个关键性保护因子，具有减少体脂、增加胰岛素敏感性、改善游离脂肪酸的代谢、抗动脉粥样硬化等作用。NAFL患者也普遍存在低APN血症，而且血清APN水平与肝脏脂肪变性和炎症程度呈负相关，外源性APN可以明显改善NAFL动物肝脏脂肪沉积和炎症坏死。APN对四氯化碳，酒精等引起的肝损伤还有保护作用。因此脂联素可能是代谢综合症与NAFLD内毒素高敏感性之间的一座桥梁。

3　特殊类型脂肪肝

3.1 Reye综合征

　　Cooperstock等首先报道了Reye综合征患者血浆内毒素水平增高，从而提示内毒素在本病发生中所起的作用。之后，Corkey等又报道，Reye综合症患者血浆TNF水平比正常者和康复者均高，而TNFα可引起肝细胞线粒体功能障碍，后者Reye综合征的特征性病理改变。给于禁食的SD大鼠低于致死剂量的内毒素，可使其产生类似于Reye综合征的代谢改变和病理改变。内毒素与阿司匹林对Reye综合征的发病还有协同作用。体外研究表明，阿司匹林及其它非甾体类抗炎药可促进巨噬细胞产生TNF。给予禁食的SD大鼠低剂量的内毒素和阿司匹林，可制造出Reye综合征的动物模型，且某些指标更接近于Reye综合征的临床改变，如ATP或ADP的下降、酮体生成的减少、支链氨基酸氧化产物酰基CoA的堆积等。

　　由此，有学者提出了如下设想，即由于某些获得性或先天性原因，一些儿童的单核-巨噬细胞系统对内毒素敏感，或者对内毒素的清除能力下降，从而使巨噬细胞产生TNFα、IL-1等细胞因子，阿司匹林则促进了这一作用。TNFα、IL-1等细胞因子一方面可以抑制肝细胞脂肪酸氧化，使非酯化脂肪酸增加，肝细胞内三酰甘油堆积，并使酮体和乙酰CoA生成降低，减少了ATP的生成，另一方面，这些细胞因子还可促使骨骼肌蛋白降解，释放氨基酸，主要是支链氨基酸，支链氨基酸氧化则生成各种酰基CoA的中间产物，后者可抑制体外培养的大鼠肝细胞尿素生成、酮体生成、葡萄糖异生等代谢紊乱，引起Reye综合征特有的代谢紊乱。当然，阿司匹林本身也有抑制肝细胞脂肪酸氧化以及降低三羧酸循环活性的作用。

3.2 TPN相关性脂肪肝

　　肠道菌群紊乱及肠源性内毒素血症也是TPN相关脂肪肝发病机制之一。接受TPN者一般有较为严重的基础疾病，原本就较易发生肠源性内毒素血症，而TPN更是促进了肠源性内毒素血症的发生。如Takagi等观察了29例经胸食管手术患者，其中18例术前术后接受TPN，另11例接受肠内营养（Enteral nutrition, EN）。结果接受TPN患者术后血清内毒素水平明显高于接受EN患者。Sugiura等报道，接受TPN的大鼠烧伤后48小时尿中的肾上腺素和去甲肾上腺素水平较接受EN的烧伤大鼠高，肝脾的内毒素水平也更高，肠粘膜萎缩则更明显，且尿去甲肾上腺素水平与肝脾的内毒素水平呈正相关，与肠粘膜的重量呈负相关，提示TPN提高了烧伤后的应激反应，并促进肠粘膜的萎缩、肠源性内毒素血症的发生。急性胰腺炎的大鼠，接受TPN或EN后，肠粘膜的萎缩程度和血清内毒素水平也有相似改变，而且TPN大鼠脾脏和外周血的T细胞CD4/CD8低于EN大鼠。另外，多项研究还表明，正常实验动物接受TPN后，内毒素的敏感性明显提高，小剂量的内毒素即可引起很高的死亡率，而接受TPN的志愿者静脉注射内毒素后，肝静脉内TNF水平也明显高于接受EN的志愿者。

　　TPN不仅促进了内毒素血症的发生，而且通过内毒素血症导致脂肪肝的形成。临床和动物实验表明，给予灭滴灵口服净化肠道或抗TNF-α抗体拮抗TNF-α，以及给予谷氨酰胺防止肠粘膜萎缩均可明显改善脂肪肝的病理改变，这些结果很好地证实了TPN相关脂肪肝与内毒素血症有关。

　　TPN促进内毒素血症发生的机制，主要是由于TPN期间肠道缺乏食物刺激，肠道蠕动减少，小肠粘膜萎缩，肠道免疫力下降，细菌过度生长并发生移居现象。分泌型IgA（S-IgA）主要来源于胆汁，是肠粘膜免疫防御系统的主要成分，可以防止细菌粘附于肠粘膜。正常大鼠接受TPN 16天后，胆汁S-IgA含量较接受EN和正常饮食的大鼠明显减少，而改为正常饮食8天后，胆汁S-IgA含量即上升。S-IgA分泌的减少可能与缺乏食物抗原刺激肠道B淋巴细胞有关。肠道S-IgA分泌的减少以及肠道蠕动的减少，导致肠道细菌过度生长，肠粘膜的萎缩使肠道通透性增高，导致细菌及内毒素的移居。正常大鼠接受TPN 2周后，盲肠匀浆细菌培养菌落计数，无论是需氧菌抑或厌氧菌，都较正常饮食的大鼠明显增高，其中又以革兰阴性菌为主，肠系膜淋巴结细菌培养亦为阳性。

3.3　小肠旁路术相关性脂肪肝

　　上世纪60年代中后期，国外开始采用小肠旁路术治疗病态性肥胖，其中又以空-回肠旁路术居多。此类手术减肥效果明显，可使增高的体重下降60%-80%以上，且反弹率较低。但手术的死亡率高达1%以上，且并发症众多，如关节炎、皮炎、腹泻、营养不良，肝脏并发症主要为脂肪性肝炎，有时还可进展为肝硬化，甚至导致肝功能衰竭。除了脂肪和蛋白质营养不良、碳水化合物摄入过多以及体内脂肪分解加速导致的游离脂肪酸增多与脂肪性肝炎发病有关外，肠道细菌过度生长及其继发的内毒素血症可能在肝脏损害发生中亦起重要作用。

　　Corrodi等报道3例小肠旁路术后患者的有功能小肠的内容物培养菌落计数在105.0-107.6/ml，高于正常远端回肠菌落计数，且菌群的组成类似于粪便，而4例患者废用的肠襻内容物培养菌落计数更高，在106.4-109.7/ml，菌群的组成亦类似于粪便。实施回-结肠旁路术的犬与实施小肠切除术的犬相比，前者体重下降、肝功能异常和肝脏脂肪变均更明显，肠道菌落计数也更高，其中又以厌氧菌的增多更为明显。动物实验还提示，服用灭滴灵等抗生素或切除废用的肠襻可以防止或减轻小肠旁路术后肝脏损害的发生。故不少学者认为，废用的肠襻内细菌过度生长并继发内毒素血症是导致小肠旁路术后肝脏损害的重要原因。另外由于小肠旁路术后肝脏损害与酒精性肝病在组织病理学上有着许多共同点，如脂肪变、Mallory小体、窦周胶原沉积、门管区纤维化等，故有学者提出两者可能有一些共同的发病机制，如肠源性内毒素血症。但目前尚无直接证据表明小肠旁路术后患者存在肠源性内毒素血症并与其肝脏并发症相关，故上述推测有待于进一步研究证实。

参考文献

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